一、基因水平的精準設計

 

　　表達的成功始于基因的設計。密碼子偏好性是首要考量。大腸桿菌對某些同義密碼子具有明顯的使用偏好，若外源基因中含有過多稀有密碼子，尤其是連續存在時，會嚴重拖慢翻譯速率，導致核糖體停滯、翻譯錯誤甚至提前終止。因此，在不改變氨基酸序列的前提下，將外源基因的密碼子優化為大腸桿菌的偏好類型，是提高表達量的常規且有效的手段。

 

　　其次，表達載體的選擇與構建至關重要。強效且可調控的啟動子，如T7、lac、trc等，能驅動基因的高水平轉錄；而一個有效的核糖體結合位點（RBS）及其與起始密碼子之間的序列和間距，則直接決定了翻譯的起始效率。此外，載體拷貝數也需根據目標蛋白的特性進行權衡，高拷貝數通常意味著高轉錄水平，但有時也可能加重細胞代謝負擔或導致質粒不穩定。

 

　　二、表達條件的精細調控

 

　　即使擁有了基因序列，表達過程的調控同樣決定成敗。誘導條件是其中的關鍵環節。對于常用的IPTG誘導系統，誘導時機（通常在對數生長中期）、IPTG濃度、誘導時間以及誘導溫度都需要精細優化。例如，對于易形成包涵體的蛋白，采用低溫（如25-30℃）和低濃度IPTG進行緩慢誘導，有助于肽鏈正確折疊，增加可溶性蛋白的比例。

 

　　培養基本身也是不可忽視的因素。豐富的培養基（如TB、2xYT）能支持更高的菌體密度和蛋白產量。溶解氧的充足供應對于好氧的大腸桿菌至關重要，在高密度發酵中尤其需要精確控制通氣量和攪拌轉速。同時，培養液的pH值應維持在最適生長范圍內（通常為6.8-7.4），以保障菌體的活力和代謝穩定。

 

　　三、目標蛋白自身的特性與宿主改造

 

　　目標大腸桿菌表達重組蛋白的自身屬性，如其氨基酸序列、分子大小、結構復雜性以及是否存在對宿主有毒的活性，都會深刻影響其最終產量。疏水性過強或含有多個二硫鍵的復雜蛋白，在大腸桿菌中表達時極易形成不溶性的包涵體，或發生錯誤折疊。

 

　　針對這些問題，除了優化表達條件，還可以對宿主菌株進行改造或選擇。使用Origami、Rosetta-gami等能促進二硫鍵正確形成的菌株，或表達分子伴侶（如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ）共表達的菌株，可以有效提高復雜蛋白的可溶性和正確折疊率。對于毒性蛋白，則需選擇嚴密控制的表達系統，在生長階段抑制其表達，待菌體量達到要求后再進行強力誘導。

 

　　四、下游加工的策略考量

 

　　表達策略的選擇直接影響下游加工的難度和最終收率。當目標蛋白以包涵體形式存在時，雖然易于通過離心初步純化且能避免被蛋白酶降解，但后續繁瑣的變性與復性過程常導致活性回收率低下。反之，可溶性表達雖然簡化了下游工藝，但可能需要更復雜的色譜步驟進行純化，且在發酵液中可能更不穩定。因此，需根據最終應用目的（是否需要天然活性）來權衡和選擇表達策略。